Тепловой поток через открытую пору способствует непрерывной репликации нуклеиновых кислот и отбору более длинных цепочек
С помощью имитации куска пористой породы из сети крошечных стеклянных капиллярных трубок, которые нагревали с одной стороны, группа немецких ученых создала условия, в которых может быть достигнута стабильная репликация длинных цепочек нуклеиновых кислот (главная предпосылка для возникновения жизни на Земле) и преодолены термодинамические причины их деградации. Ученые предполагают, что на ранних стадиях эволюции Земли такие условия могли возникать в потоке тепловой энергии через пористые породы вблизи гидротермальных источников.
Механизмы репликации нуклеиновых кислот занимают центральное место в теории происхождения жизни на Земле. Согласно этой теории, функцию хранения генетической информации и катализа химических реакций первоначально выполняли комплексы молекул рибонуклеиновых кислот. В ходе дальнейшей эволюции они были заменены комплексами ДНК-РНК-белок, обособленными от внешней среды мембраной. В ходе первичной эволюции на Земле полимеры нуклеиновых кислот должны были постепенно увеличиваться в размере, для того чтобы они смогли принять на себя функцию хранения и воспроизведения информации, которая необходима для нормального функционирования живых организмов. Например, даже самый маленький известный в науке геном бактерии Carsonella (внутриклеточный симбионт насекомых листоблошек) насчитывает 159 662 пар оснований, что в тысячи раз длиннее «геномов» самореплицирующихся рибозимов.
Однако еще в конце 1960-х эксперименты по искусственной эволюции нуклеиновых кислот in vitro (в пробирке) показали, что генетическая информация из длинных молекул нуклеиновых кислот быстро теряется. Происходит это потому, что для самовоспроизведения коротких молекул полимеров требуется меньше материала. Скорость их синтеза намного выше, и это приводит к тому, что короткие молекулы постепенно вытесняют из реакционной среды более длинные молекулы генетических полимеров. Более того, если мутации в процессе репликации могут изменить длину последовательности нуклеинового полимера, то «выживание» только коротких последовательностей — практически неизбежный эволюционный финал.
Так, Сол Шпигельман с коллегами в своих классических исследованиях ввели РНК, выделенную из простого бактериофага Qв, в реакционную смесь, которая содержала фермент репликации РНК того же вируса Qв (так называемая РНК-зависимая РНК полимераза, или РНК-репликаза) и материал для построения новых РНК — одиночные нуклеотиды. В этой среде запустился процесс синтеза новых молекул-копий вирусной РНК. Через некоторое время из исходного раствора небольшая часть синтезированной РНК была перенесена в пробирку со свежей реакционной смесью. Этот процесс регулярно повторяли (см. D. Kacian et al., 1972. A Replicating RNA Molecule Suitable for a Detailed Analysis of Extracellular Evolution and Replication).
В результате через 74 цикла подобных переносов оригинальная цепь, состоявшая из 4500 нуклеотидных оснований, трансформировалась в карликовый геном, содержавший всего 218 оснований. Полученный таким образом Шпигельмановский монстр был способен к очень быстрому размножению. Позднее, в 1997 году, было показано, что в ходе дальнейшей эволюции монстр Шпигельмана становится еще короче. Его «геном» редуцируется всего до 48 или 54 нуклеотидов, которые просто являются местами связывания фермента РНК-репликазы (F. Oehlenschläger, M. Eigen, 1997. 30 Years Later — a New Approach to Sol Spiegelman's and Leslie Orgel's in vitro EVOLUTIONARY STUDIES Dedicated to Leslie Orgel on the occasion of his 70th birthday).
Следовательно, возникает совершенно закономерный вопрос: каким же образом в ходе ранних стадий земной эволюции самопроизвольно протекающий процесс редукции наследственного материала мог бы быть преодолен? Как раз на него и попытались ответить немецкие ученые из Центра нанонауки Мюнхенского университета Людвига–Максимилиана. Они предположили, что довольно простые физические процессы, которые лежат в основе модели выживания более длинных молекул (рис. 1), могут встречаться в естественных условиях в пористых горных породах вблизи гидротермальных источников.
Прежде всего, необходим тепловой поток через небольшие поры, который создает внутри пор температурный градиент. Внешний поток приносит в открытую пору молекулы полимеров разной длины. Подогрев с одной стороны поры слегка уменьшает плотность жидкости, она начинает подниматься по этой стороне. Молекулы полимеров растут, получая строительный материал из внешнего потока, перемещаются в результате диффузии к более холодной части поры и там осаждаются более холодным нисходящим потоком жидкости (движение молекул из зоны с более высокой температурой в зону с более низкой называют термофорезом). В итоге, из-за разности температур, возникает микроциркуляция воды, которая и удерживает более длинные молекулы полимеров, а более короткие молекулы вымываются из поры. Авторы отмечают также, что местная конвекция, которая переносит молекулы постоянно между теплой и холодной зонами, вызывает их циклическую денатурацию. Денатурация ДНК заключается в расплетании и разделении цепей (без разрыва ковалентных связей), что способствует репликации молекул полимеров. Таким образом, сочетание внешнего притока, термофореза и конвекции избирательно улавливает длинные молекулы и вымывает короткие, а общая скорость внешнего притока определяет предельный размер молекул, которые будут «выживать» в данных условиях.
Рис. 1.Локальное снижение энтропии является ключевой особенностью живых систем и может быть вызвано потоком тепловой энергии.a — современные клетки питаются химической энергией, что позволяет им содержать, поддерживать и реплицировать кодирующие информацию полимеры, что необходимо для дарвиновской эволюции.b — поток тепловой энергии через геологические трещины вблизи источника тепла.c — (1) температурный градиент в пределах трещины миллиметрового размера индуцирует накопление молекул посредством термофореза и конвекции; (2) внешний поток приносит строительные материалы в открытую пору; (3) экспоненциальная репликация облегчается местной конвекцией, которая переносит молекулы постоянно между теплой и холодной зонами и, таким образом, вызывает циклическую денатурацию нуклеотидов; (4) сочетание внешнего притока, термофореза и конвекции избирательно улавливает длинные молекулы и вымывает короткие. Скорость притока определяет предельный размер молекул в результате отбора по их длине. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Chemistry
Чтобы проверить эту гипотезу, Браун и его коллеги создали имитацию куска пористой породы из сети крошечных стеклянных капиллярных трубок, которые нагревали с одной из сторон. Они проделали целую серию опытов, в которых отдельно исследовали накопление молекул в капиллярах и фракционирование молекул в тепловом фильтре (рис. 2).
Рис. 2.«Тепловой фильтр», отбирающий нити по длине.a. Открывание ассиметрично подогреваемой поры запускает постоянный восходящий «пищевой» поток. Маркер длин двухцепочечных молекул ДНК (от 20 до 200 пар нуклеотидов с шагом 20 пар нуклеотидов), был введен в капилляр-ловушку для оценки длины цепей улавливаемых молекул. Последующая промывка капилляра чистым буфером с постоянной скоростью (vs = 6 микрометров в секунду) продемонстрировала пороговое свойство фильтра — цепочки меньше или равные 80 пар нуклеотидов вымывались из поры, в то время как более длинные цепочки удерживались внутри.b. Несимметричная структура потока создается наложением восходящего потока и конвекции. Термофорез толкает длинные цепочки в нисходящий поток и захватывает их: накапливает более длинные молекулы в нижней части нисходящего потока. Короткие цепочки подвергаются влиянию общего восходящего потока и покидают пору. Захват цепочек фильтром является функцией скорости общего «пищевого» потока.c. Скорость внешнего потока vs регулирует разделение нуклеиновых кислот (в поре остаются более длинные молекулы). Как и в эксперименте (a), маркер длин двухцепочечных молекул ДНК был вначале введен при малой скорости потока, которую затем последовательно увеличивали. Высвобожденные из теплового фильтра ДНК измеряли с использованием гель-электрофореза.d. Удержанные фильтром фракции ДНК, полученные из электрофорезного геля, составляют ландшафт отбора (в двухмерном пространстве факторов: скорость потока — размер молекулы) в пользу длинных олигонуклеотидов в этой термальной среде обитания. Зависящая от скорости захватываемая фракция (то есть молекулы определенной длины: чем выше скорость потока, тем более тяжелая фракция задерживается в поре) описывается моделью динамики в жидкости. Линии разброса отражают соотношение сигнал/шум изображений геля.Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Chemistry
И конечно же, они изучали действие отбора в созданных ими условиях в популяции реплицирующихся молекул (рис. 3). В последнем эксперименте в раствор вводили термостабильную ДНК-полимеразу (см. также Taq polymerase). В экспериментах они использовали не фрагменты РНК, а фрагменты ДНК. Фрагменты ДНК намного проще получить в лабораторных условиях, а процессы взаимодействия молекул ДНК и РНК со средой очень сходны.
Рис. 3.Отбор в популяции реплицирующихся молекул ДНК, населяющих термальные местообитания.a. Молекулы ДНК подвержены температурным колебаниям, которые обусловлены совместным влиянием термофореза, конвекции, «пищевого» потока и диффузии. Моделирование случайных траекторий молекул продемонстрировало, что цепочки длиной 75 пар оснований циркулируют в системе в среднем 18 минут. Цепочки длиной 36 пар оснований из-за их повышенной диффузии демонстрируют более быструю циркуляцию, но вымываются из системы после пяти минут.b.Термостабильная ДНК-полимераза участвует в репликации двухцепочечных молекул ДНК длиной 80 пар оснований в процессе температурной конвекционной циркуляции. Количественные измерения ДНК, окрашенные флуоресцентным красителем (SYBR Green I), демонстрируют экспоненциальную репликацию с временем удвоения 102 секунды.c. Открытая пора (см. рис. 1c) была заселена популяцией, состоящей из двух типов нуклеиновых кислот (36 и 75 пар оснований). Количественный электрофорез в геле показал устойчивую репликацию (сохранение в среде в течение 7 часов, до конца эксперимента) только более длинных молекул. Более короткие цепочки снижали численность и затем исчезали (вымывались из реакционной среды), вопреки их более быстрой репликации (меньшему времени удвоения числа молекул).d. Относительные концентрации двух конкурирующих видов внутри термальных местообитаний. Давление отбора, вызванное термальным градиентом, изменяет в течение времени структуру популяции, состоящей из двух типов молекул (желтые прямоугольники), в соответствии с аналитической моделью репликации. Значения абсолютной приспособленности 1,03 и 0,87 для более длинных и более коротких цепочек соответственно. Без температурного градиента более короткие нуклеотиды выигрывают у более длинных молекул (синие кружки), аналогично данным экспериментов Шпигельмана. Линии разбросаотражают соотношение сигнал/шум изображений геля.Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Chemistry
Как только исследователи стали проводить эксперименты, они тут же обнаружили, что более длинные цепочки ДНК чаще сохранялись в капиллярах, чем более короткие (рис. 2). В результате более длинные цепочки полимеров воспроизводились намного лучше внутри поры и их число увеличивалось, в то время как более короткие последовательности сократили «численность» настолько, что в итоге они вымерли (рис. 3).
Таким образом, Брауну и его коллегам удалось подобрать такие экспериментальные условиях, в которых стабильно сохранялись цепочки нуклеиновых кислот длиннее монстра Шпигельмана приблизительно в 4 раза. Более того, так как скорость притока определяет предельный размер сохраняющихся в капиллярах молекул, то принципиально возможно подобрать такие условия, при которых будут «выживать» еще более длинные молекулы полимеров.
Другой интересной особенностью проведенного эксперимента был процесс «расселения» полимеров. Когда репликация и захват молекул внутри поры достигают устойчивого состояния, то вновь реплицированные молекулы покидают ловушку-пору вместе с «кормовым» потоком. Это обеспечивает эффективную передачу генетических полимеров в соседние системы пор.
Авторы публикации отмечают, что если в представленную систему ввести процесс мутирования, то такие эксперименты предоставляют захватывающую возможность изучать механизмы дарвиновской эволюции, которые могли бы протекать среди населения молекул в температурных градиентах ранней Земли.
Обсуждаемая статья: Moritz Kreysing, Lorenz Keil, Simon Lanzmich & Dieter Braun. Heatflux across an open pore enables the continuous replication and selection of oligonucleotides towards increasing length // Nature Chemistry. Published online 26 January 2015. Doi:10.1038/nchem.2155.
Автор:Владимир Гриньков
